在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。制种程序可参考 图13。
 
　　(一）母种的分离培养
　　食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
 
　　1.孢子分离法
　　孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。
　　（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子， 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。
　　（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：
　　①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇 为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
　　还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。
　　②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
　　③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。
　　④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块， 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。
　　孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。
　　孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。
　　一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。
　　现就银耳孢子分离略述于下：
　　按无菌操作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳，置 20℃—25℃温箱培养2～3天，培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。经30天左右，菌落长出白色菌丝。
　　银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌（香灰菌丝）混合培养时，由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳孢子萌发，菌丝的定植和子实体的形成。
　　在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。
　　羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端菌丝，转管移接，置25℃—28℃上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。
　　银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时，先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面，按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一 小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。

　　2．组织分离培养法
　　利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便方法，即组织分离。该法操作简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。
　　（l）子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以0.1％的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织；移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。
　　（2）菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA 培养基斜面上，保温培养。应注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。
　　（3）菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次， 然后去掉黑色外皮层（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。
　　菌素分离要注意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格操作。　

　　3．基内菌丝分离培养法
　　利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。
　　此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。
　　（1）材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇（耳）木在分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇（耳）水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或再用0.1％的升汞水浸孢几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取；菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳）木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃ 的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。
　　　（2）土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌；孢子不易萌发。组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。
　　土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌 生长的药物，如 40微克／升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。
　　（3）子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明：
　　从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于 0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针， 塞上棉塞。 为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后，分离物的边缘就可看 到白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。

　　（二）原种和栽培种的接种培养
　　母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。
　　原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。
　　瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30℃以下，可按照无菌操作程序进行接种。
　　菌种瓶（袋）放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出