蘑菇培养料的二次发酵是指培养料经过堆制，在最后一次翻堆后、当料温升至50℃～60℃时趁热运进发酵室，在10～12个小时内升温至60℃～62℃并保持４～６个小时，然后通风降温至48℃～52℃并保持４～５天。实践证明，培养料二次发酵后栽培蘑菇，产量比一次发酵的高出40％左右。现介绍两种常用的二次发酵方法及应注意的问题。
    室内加温后发酵
    选选择密闭性较好的菇房关闭门窗，堵塞通风口。在第一次发酵第三次翻堆后，当料温升至 50℃～60℃时将培养料趁热运进菇房，集中堆放在中层。当料温为45℃时，立即将室外旺盛燃烧的煤炉搬进菇房，用猛火升温。为保证菇房内的湿度，可在煤炉上放一锅水。升温时间越短越好，应在10～12个小时内达到60℃～62℃并保持４个小时。然后，开窗通风，使温度降至48℃～52℃并保持４天。
    室外覆膜后发酵
    选好发酵场地，砌好通风道或在堆制过程中用木棒留通气孔。以通风道为中轴，将培养料翻至二次发酵场地，堆成1.5～２ｍ宽、0.8～１ｍ高的料堆，用竹竿在料堆上弯成弓形支架，两端插入地下，支架与料堆距离约30ｃｍ，用薄膜覆盖在上面，四周压紧，即可进行二次发酵。
    不论采用哪一种方法进行二次发酵，都应注意以下几点：①二次发酵是在一次发酵的基础上进行的，首先要保证一次发酵的质量。②散堆后，培养料要尽快搬入房中，集中堆放，不要散开，以放在中层为宜。③要注意培养料的含水量。在二次发酵前要补足水分，用石灰水调整含水量至65％～70％、ph值为7.5～８。④二次发酵的温度为55℃～60℃并保持４个小时，控温阶段保持48℃～53℃４天。⑤适时结束发酵，通风降温，以保证培养料的发酵质量。二次发酵时间的长短，取决于一次发酵时间的长短及料熟程度，一次发酵时间长且料偏熟时，二次发酵的时间可缩短。⑥二次发酵结束后，培养料如散发出甜香味且无氨臭味、颜色为深棕红色、表面长有白色放线菌时，即为发酵成功。