蘑菇孢子别离法，是使用老练子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培育基上，使孢子萌生成菌丝，取得纯种的一种办法。孢子别离可分为单孢别离和多孢别离法两种，因为是从有性担孢子（是指其细胞核现已地核配进程）别离纯菌丝体，因而出产上多选用多孢别离法来坚持菌株的原有特性，而单孢别离法首要使用于菌株的选择和杂交育种等作业，孢子别离首要分为两个步骤，首先是搜集孢子，其次进行单孢或多孢子别离。

    1、种菇的选择　搜集孢子首先要选好种菇即别离用的子实体。一般蘑菇种菇要求是榜首潮菇，出菇较早，单生，个别健壮，特征典型的子实体，通过仔细的调查选择后在菇床上做个记号，让种菇充沛成长，直至行将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。

    2、孢子弹射搜集　种菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲刷数次，再用无菌滤纸把外表水吸干，或直接用75% 酒精棉球悄悄控拭菌盖及菌柄进行外表消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制造的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩（如图　所示）。这套孢子搜集设备需事前进行高压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射搜集器放在温度为15-20℃的室内，经24-48小时左右， 可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把搜集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并在温度下进行真空枯燥，之后放入冰箱可长时刻保存备用。
（二）孢子别离

    1、多孢别离法　即把多个孢接种在同一培育基上，让它们萌生一起成长交织在一起，然后取得纯种的一种办法，因为多个孢子间的种性互补，根本上能够坚持亲本的安稳性，此法比较简易，在曩昔的蘑菇制种中使用较为遍及。

    （1）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少数孢子，在PDA试管斜面培育基上自下而上划线，划线时勿用力， 避免划破培育基外表，接种结束，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24℃恒温培育箱中培育，待孢子萌生后（一般约15-20天），选择萌生快，长势旺的菌落， 转接于新试管培育基上再行培育。

    （2）涂布别离法：按无菌操作办法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充沛摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培育皿培育基上，滚动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培育基上经24℃恒温培育萌生后，选择几株发育匀称，成长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培育基上，恒温培育即为母种。