虫草液体菌种制作及质量检验方法（下）

　　井大鹏  王明辉/文

　　（二）显微镜杂菌检查方法及步骤。

　　1、器材 显微镜，酒精灯/电炉子，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水；结晶紫染色液，碱性复红染色液。

　　2、操作步骤  涂片—干燥—固定—染色—水洗—镜检—观查结果

　　3、涂片。 取一块干净的载玻片，滴一小滴菌液于载玻片中央，用无菌操作，调匀并涂成薄膜。注意滴菌液时不宜过多，涂片必须均匀。

　　4、干燥。 于室温中自然干燥或用洒精灯/电炉子烘干。

　　5、固定。 涂片面向上，于火焰上通过2-3次，使细胞质凝固，以固定细胞的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细胞形态将毁坏。

　　6、染色。 放标本于水平位置，分别滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。结晶紫染色液染2-3分钟，石炭酸复红染色液约染1-2分钟。

　　7、水洗。 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。

　　8、镜检

　　（1）低倍镜观察

　　（2）高倍镜观察

　　（3）油镜观察

　　①用粗调节器将镜筒提起约2厘米，将油镜转至正下方。

　　②在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。

　　③从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。

　　④从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

　　⑤观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。

　　⑥将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。

　　9、观查结果：

　　细菌在培养液中染色明显（较深）呈球状，杆状。

　　（三）斜面试管或空白培养基检查法。在无菌条件下吸一滴或几滴菌液接入灭好菌后的斜面试管或空白培基上。将接过菌液的斜面试管或培养基置于24～32℃条件下培养，经24～48小时培养，观察杂菌。如菌丝生长旺盛、洁白，接种面无红、黄、绿、黑色杂菌，证明液体菌种生长正常已经成熟，然后即可使用接种；否则，说明液体菌种已污染杂菌。

　　（四） 取样测验

　　1、菌丝活力检测 用显微镜观察虫草菌丝的边缘，以及菌丝粗细和分枝。培养液静置几分钟，无菌泥下沉，为活力强。

　　2、菌丝体含量测定 取不少于100毫升发酵液，水洗至水相澄清，在砂芯漏斗上以已知60℃烘干重的滤纸真空抽滤，然后将菌丝体连同滤纸于60℃鼓风干燥2小时，迅速称重，精确至0.01克。 菌丝体干重（克/100毫升）={菌丝体干重（克）×100}/发酵液取样体积（毫升）

　　3、菌丝球数量及大小测定

　　（1） 菌丝球数量测定 取不少于50毫升的发酵液，按一定比例在带塞量筒中加水稀释，摇匀后取一定量在直径150毫米的培养皿中摊匀，培养皿下垫方格纸，用方格法计数。 菌球数（个/100毫升）={菌球数（个）×100}/相当于发酵液体积（毫升）。发酵终点菌丝球浓度每毫升1000～1500个。

　　（2） 菌丝球大小测定。 在培养皿中取30个以上菌球排成一列，测量总长度，精确至1毫米。 菌球平均直径（毫米/个）=菌球总长度（毫米）/菌球数（个） 对于发酵液中菌球只占一定比例者，可先测得菌球占整个菌丝体的体积或重量百分数，再测其大小和数量；菌球以球形或拟球形、直径大于1毫米、肉眼可辨者为准。

　　4、 PH值测定。 用PH检测仪或酸度计测定。发酵终点PH值下降至5。

　　5、总糖和还原糖测定。 采用改良裴林法测定。

　　6、氨基酸态氮测定。 采用甲醛法测定。

　　7、体积溶氧系数的测定。 采用亚硫酸盐氧化法测定。

　　液体菌种制好后，应立即使用，不能久放，若暂时不用，在常温下（15～30℃）一般可放置2～3天，最长不超过7天。放置时间太长菌种容易老化或变质。如要保存菌种，可采用冰箱低温保存，在4℃环境中存放3～6个月仍可繁殖。

　　通过液体菌种质量的检验，可以在早期及时准确地判断出液体菌种培养状态，避免盲目大批量接种栽培，以免造成不必要的经济损失，对液体菌种的生产应用起到了保障作用。（完）

　　主要参考文献：

　　［1］李昊。虫草人工栽培与深度开发。科学技术文献出版社，2003.

　　［2］潘学仁。食用菌栽培学。哈尔滨出版社，1995.

　　［3］汪维云，朱金华； 食用菌液体深层发酵技术研究进展及展望 [J];中国食用菌； 1998年02期。

　　［4］卢翠文。 北冬虫夏草液体培养条件的优化与诱变育种[D]广西师范大学， 2007 .

　　［5］康源春； 食用菌液体菌种的制作与应用 [N];河南科技报； 2004年。

　　［6］张翠霞，孟庆国，冯华，陈丽媛，孟宪志，李莉； 食用菌液体菌种在生产和使用中应注意的问题 [J];中国食用菌； 2004年04期； 50-51.