通过正交试验筛选出适宜培养姬松茸液体菌种的合成培养基（N?6Ⅰ20.0%，N?6 Ⅱ30.0%，蔗糖5.0%，酵母粉0.3%），以此制备的一级摇瓶种和二级摇瓶种，其菌丝体生物量分别为1.48±0.06 g/100 mL和2.64±0.05 g/100 mL。栽培试验表明，液体菌种的发菌时间比固体菌种缩短13 d。
　　姬松茸；?N?6培养基；?摇瓶培养；?液体菌种
　　S646.150.4A
　　
　　姬松茸（Agaricus blazeiMurrill）又名巴西蘑菇、小松菇，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，是一种很有开发前途的食药用真菌。其子实体含有多糖、核酸和甾醇类等多种生物活性物质以及人体必需的多种氨基酸等成分，经常食用，可以降低血压和胆固醇，且对肿瘤、痔疮和神经痛等具有一定疗效[1]。我国于20世纪90年代初从日本引进姬松茸菌种，近年来在福建、四川和湖北等地有一定规模的栽培，其生产用种多为麦粒种。1997年以来，有关姬松茸深层发酵的研究较多 ［2-7]，然而在姬松茸液体菌种制作的过程中，常出现一级摇瓶种子生物量较低，二级摇瓶种子菌丝球数量少、生长速度慢、菌丝球个体大和接种固体培养基萌发慢、生长无优势等问题，制约了姬松茸液体菌种在实际生产中的应用。因此，我们在以前姬松茸发酵研究的基础上，探索了姬松茸液体菌种的制作工艺，以适应工厂化制种及栽培的需要。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1材料
　　1.1.1供试菌种
　　姬松茸ABM-3号试管保藏种引自华中农业大学菌种实验中心。
　　1.1.2母种活化培养基
　　①PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L；②麸皮加富PDA培养基：麸皮100 g煮沸30 min,浸提，取汁加入PDA中；③加盐PDA培养基：PDA中加入MgSO?4·7H2O 0.5 g/L，CaCl?20.1 g/L，KH2PO?41.0 g/L，FeSO?4 0.1 g/L，（NH?4）?2SO?43.0 g/L。pH均为7.0。
　　1.1.3N?6贮备液
　　依据植物组织培养N?6培养基配方[8]，分别配制无机大量元素贮备液N?6Ⅰ和有机成分贮备液N?6Ⅱ，贮备液N?6Ⅰ的成分为：KNO?3 28300 mg/L,(NH?4)?2SO?4 4630 mg/L,CaCl2·2H2O 1660 mg/L,MgSO?4·7H2O 1850 mg/L,KH2PO4 4000 mg/L；贮备液N?6Ⅱ的成分为：烟酸50 mg/L，VB?6 50 mg/L，VB?1 100 mg/L，甘氨酸 200 mg/L。
　　1.1.4原种及栽培培养料
　　原种及栽培培养料配方均为：发酵棉籽壳84%，麸皮10%、发酵牛粪粉5%、石膏1%、碳酸钙1%、pH值7.0、含水量65%。
　　1.2方法
　　1.2.1母种活化培养
　　取ABM-3试管保藏种，分别接到3种母种活化培养基中，每管接入0.5×0.5cm菌种块一块，每个处理10支试管，于25 ℃恒温培养箱中暗培养，观察菌丝的萌发时间、满管天数和菌丝生长势。由此筛选出适宜的母种活化培养基，并将优选出的ABM-3试管种作为试验用母种。
　　1.2.2ABM-3菌液的制备
　　1.2.2.1?用于液体合成培养基筛选的一级摇瓶种制备
　　将已活化15 d的ABM-3试管种接入培养液［蔗糖2%、黄豆粉1%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、(NH?4)?2SO?4 0.1%、MgSO?4·7H2O 0.05%、CaCO?3 0.1%］中，每瓶接0.5×0.5 cm的菌丝块4块，25 ℃静置培养48 h，再于150 rpm恒温摇床培养8 d。
　　1.2.2.2?液体合成培养基筛选
　　选取N?6Ⅰ、N?6Ⅱ、蔗糖、酵母粉四因子，设计L?9（34）正交试验，试验因素与水平见表1。每处理4个重复，分装于250 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，8层纱布封口，121 ℃灭菌35 min。接入5 mL制好的ABM-3一级摇瓶种子，于25 ℃、150 rpm摇瓶培养5 d，发酵结束后，培养液经中性滤纸过滤，过程中用蒸馏水冲洗数次，于60 ℃烘至恒重,测定菌丝体干重。并依此评定筛选适宜ABM-3的液体合成培养基。
　　
　　1.2.2.3?液体静置培养
　　制备经正交试验筛选出的液体合成培养基，分装于250 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，共2瓶，瓶中各放入磁力搅拌子一个，灭菌后每瓶接入4块（0.5×0.5 cm）已活化的ABM-3试管种，25 ℃暗室静止培养5 d后，将锥形瓶置于磁力搅拌器上搅拌培养12 h,获得含有菌丝片断的菌液。
　　1.2.3摇瓶培养
　　将液体静置培养得到的菌液，按10%的接种量接入筛选出的液体合成培养基中（250 mL锥形瓶，50 mL装量），于25 ℃、150 rpm摇瓶培养5 d，制得一级摇瓶种10瓶；参照蔡德华等（2003）[6]的配方选用250 mL锥形瓶装量70 mL，接入10％一级摇瓶种，25 ℃、190 rpm培养5 d，得到二级摇瓶种10瓶。分别随机抽样3瓶测定一级摇瓶种和二级摇瓶种的菌丝体生物量。
　　1.2.4栽培试验
　　培养料采用17×36 cm聚乙烯折角袋分装，装料高度为12 cm,121 ℃灭菌2.5 h。将二级摇瓶种接入栽培袋的培养料中，每袋接种菌液10 mL。原种制备采用250 mL锥形瓶分装,装料高度为3 cm,25 ℃培养15 d。 将固体原种接入同样栽培袋的培养料中作为对照，每袋接入薄薄一层原种覆盖料面。每处理接种10袋，于25 ℃恒温培养，比较菌丝满袋的时间。

　　2 结果与分析
　　
　　2.1母种活化培养试验结果
　　姬松茸菌丝在不同活化培养基上的生长见表2。①号培养基上菌丝稀疏；②号培养基上，菌丝茂密，先端整齐，气生菌丝发达；③号培养基上菌丝萌发快，但后期菌丝与①号培养基上的菌丝生长势相当，明显差于②号培养基上的菌丝，这可能是培养基中的小分子无机营养成分能更快地被姬松茸利用所致。由此可知，麸皮加富PDA培养基是适宜于ABM-3母种活化和扩繁的培养基。
　　2.2液体合成培养基正交试验结果
　　N?6培养基提供N源、矿质元素及生物因子，蔗糖和酵母粉提供C源、N源，进行L?9（34）正交试验，测定菌丝体干重。由表3可知，7号组合的菌丝体干重最高，达到0.85 g/100 mL,极差表明，各因子的最优组合是A?2B?3C?3D?2，即N?6Ⅰ20.0%，N?6 Ⅱ 30.0%，蔗糖5.0%，酵母粉0.3%。
　　
　　由R值的比较得出A＞C＞B＞D可知，四因素中N?6Ⅰ对菌丝体生物量的影响最大，而酵母粉的影响最小。这与贾薇等 ［9](2002)的报道相一致。
　　2.3液体静置培养
　　姬松茸菌丝在液体合成培养基上静置培养过程中，无论是在液面，还是在液内菌丝均能蔓延生长，培养5 d可形成松散的菌絮。将培养的锥形瓶置于磁力搅拌器上，转动的磁力搅拌子将菌絮打散，经过12 h即可获得含有大量菌丝片断的菌液。
　　
本文原文
　　2.4一级摇瓶种子
　　在制备用于液体合成培养基筛选的一级摇瓶种的过程中观察到：原试管种小块很快结块成团，很难得到分散的菌丝球；培养6 d后，菌丝开始挂附于瓶壁，继续培养2～3 d才可见培养液中有较为均匀的菌丝球，但数量较少，整个培养周期为9～12 d。而用液体静置培养后的菌液转入一级摇瓶培养，5 d后即可见菌丝挂壁，合成培养基醪液中含有大量直径约2～3 mm的白色菌丝球,其菌丝体生物量为1.48±0.06 g/100 mL。但随培养时间的延长，菌丝球的颜色逐渐由白变棕、由棕而黑，失去活力。故宜选用培养5 d左右的一级摇瓶种子转接二级摇瓶培养。
　　2.5二级摇瓶种子
　　二级摇瓶培养5 d，菌丝体生物量可达2.64±0.05 g/100 mL,菌液内充满菌丝球，直径约2～3 mm,大小均匀，是非常适合于生产用的液体菌种。
　　2.6栽培试验
　　采用液体菌种接种袋装栽培培养料，菌丝一般20～22 d满袋；而用固体原种（对照）接种相同培养料，菌丝32～35 d才满袋。液体菌种发菌比对照缩短13 d。
　　
　　3 小结
　　
　　3.1?试验表明，麸皮加富PDA培养基是适宜于ABM-3母种活化和扩繁的培养基。正交试验筛选出适宜培养姬松茸菌液的液体合成培养基配方为：N?6Ⅰ20.0%，N?6 Ⅱ30.0%，蔗糖5.0%，酵母粉0.3%，以此液体培养基制备一级摇瓶种和二级摇瓶种，其菌丝体生物量分别为1.48±0.06 g/100 mL和2.64±0.05 g/100 mL。栽培试验表明，液体菌种在培养料上发菌快，可缩短生产周期。
　　3.2?本试验采用由静置培养到摇瓶培养、由合成培养基到天然培养基的工艺制作姬松茸液体菌种，并提出姬松茸液体菌种制作的工艺为：母种活化→液体静置培养→一级摇瓶培养→二级摇瓶培养。对于大规模生产液体菌种，还有待进一步研究。