制种是食用菌生产中的关键环节，菌种好坏直接影响食用菌的产量和质量。菌种的好坏又取决于多个因素，如培养基的制备、种源质量、接种技术、保存条件等等。按菌种培养的不同阶段，可分为母种、原种和栽培种三类。母种质量的优劣直接影响到原种和栽培种的质量，所以说在把关母种质量环节上；各种影响因素显得尤为重要。母种培养基的制备看似简单，要真正做好也非易事。现在有许多栽培户自己制作母种，由于制作规程不严格，极易出现问题，又由于缺乏系统的专业知识，出现问题也不会解决，致使菌种污染，造成损失。现就如何提高制作母种培养基的质量，通过制作过程中的几点注意事项进行阐述，希望给从事菌种制作的技术人员和食用菌栽培户提供借鉴和帮助。

　　马铃薯培养基（PDA）适合多类食用菌菌丝生长，在制备母种培养基中多以PDA为主，现以PDA为例阐述母种培养基制备中的几点注意事项。在PDA的制作过程中一般分为材料准备、培养基制作、培养基分装、灭菌、冷却五个步骤。以下就每个步骤注意事项分别进行阐述：

　　1  材料准备

　　1.1　注意在选取土豆时，应选用无生芽、无青斑的土豆，因为土豆芽部的毒素会影响到菌丝的生长，若在保存过程中土豆生芽，可将芽部彻底清除再用。

　　1.2　在土豆去皮后，一般切成厚度为0.2cm的薄片，因为土豆片的大小、薄厚会影响相同时间内煮制的效果，如果切的较厚，煮制时间较短，就会影响土豆营养汁液的获取量，继而影响培养基的质量。一般0.2cm厚的土豆片煮制时间控制在10min为宜。

　　1.3　在培养基制作中，要用到起凝固作用的琼脂条或琼脂粉，在实际操作中考虑到成本问题，多选用琼脂条，但琼脂条加热后不容易溶化，如果培养基中留有未溶化的琼脂条，就会影响到培养基的凝固效果。解决办法是将称量好的琼脂条用热水提前浸泡，让琼脂条充分吸水软化，便于加热溶化。注意：在夏季制备培养基时琼脂条的使用量可增加2～4g，便于高温时的凝固。

　　1.4　注意在煮土豆片前的加水量，以做1000mL为例，在煮制之前要加水1200～1300mL，由于在煮制过程中水分会不断蒸发，致使部分水分散失，所以在煮制前将会蒸发散失掉的200～300mL水补充进去。这样避免因煮制好后水量不足，加入清水造成营养液稀释现象。

　　2  培养基制作

　　2.1  将切好的土豆片加入到1200～1300mL水中，先用大火煮至开锅后计时，再用文火煮10min后停火，冷却过滤。注意计时后用文火煮，不要盲目的认为大火煮制会将土豆中的营养全部煮出来，大火煮制不但会将土豆煮烂煮粘，还会把土豆中的大量淀粉混于营养液中，不利于过滤。注意文火煮制时，让水略微沸腾即可，锅盖虚掩防止水分大量散失。

　　2.2  将煮好后的土豆汁液经4层纱布过滤，注意至少用4层纱布过滤，目的是为了将煮出的土豆营养液充分的过滤出来，并排除其他杂质。通过纱布过滤出超过1000mL营养汁，超过1000mL是为了在溶化琼脂的过程中弥补水分蒸发的缺失。

　　2.3  在加热溶化琼脂阶段注意，加热溶化时火不要太急，用玻璃棒一边搅拌琼脂一边溶化，防止琼脂沉于锅底而糊锅。加热至沸腾时，将火调至文火继续加热搅拌，直到用玻璃棒从锅底挑不出未溶化的琼脂为止，注意保持营养液1000mL。

　　3  培养基的分装

　　3.1  要提前准备分装培养液的试管，并要注意：试管一定要刷洗干净（有条件的可用餐洗净或其它洗洁净），倒置沥干水分；成装试管的容器不要封闭，封闭的容器不利于水分散失 （有条件的可用烘箱烘干）。试管中若残留水分会导致灭好菌的试管中水份过大影响接种和发菌。

　　3.2　分装培养液时一定要在培养液温度较高时分装，不但分装速度快而且培养液不易凝固。培养液分装时一般采用医用胶皮管将培养液导流入试管，注意将胶皮管插入试管内一段距离，不要接触管口，不要将培养液粘到管口。一般试管的装液量占试管容积的2/5，以这个容量斜面摆放试管时，不致于斜面过短影响试管利用率或斜面过长接触到棉塞增加污染机率。

　　3.3　将分装好的试管冷却一下进行棉塞封口，注意尽量用新做的棉塞，用过的棉塞在受潮后极易滋生杂菌。在制作棉塞时注意，由里到外将棉塞依次裹紧，不要松散，将做好的棉塞塞入管口内2/3，管口外留1/3，棉塞做的要松紧适宜，以将棉塞拔出管口听到砰的一声响为宜。注意在塞入棉塞前要将管口擦净，不要有残留的培养基，残留的培养基灭菌后不但会与管口粘合致使棉塞拔不出，而且在发菌过程中管口的培养基极易污染到杂菌。

　　3.4  灭菌前一般要用牛皮纸将试管包裹（7支/把），牛皮纸隔水透气是最理想的灭菌包裹材料，也可重复使用。许多农户自己在制作试管时，为了降低成本一般采用报纸包裹，建议在用报纸包裹时最好采用双层报纸包裹，因报纸在灭菌中极易吸水破裂让棉塞暴露在空气中，增加污染机率。若将试管作为菌种保藏时，不建议用报纸包裹，因为报纸在0～4℃低温冰箱保存时，极易吸收冰箱内的湿气造成管口棉塞受潮，增加污染机率缩短保藏时间。

　　4  灭菌

　　4.1  现在许多农户在自己制作试管培养基时常用高压锅代替，用高压锅灭菌不易掌握灭菌的准度，改装过的高压锅自身也存在着安全隐患，所以在灭菌试管时最好用正规的医用灭菌锅。

　　4.2  高压蒸汽灭菌是利用蒸汽在高压作用下的穿透力达到灭菌的效果，所以在灭菌前要在锅与内胆之间加适量的水，水的适量度在平与锅底内的三脚架为宜，水量过多会造成灭完菌的试管湿度过大，水量过少会满足不了灭菌过程中的需要。

　　4.3  在锅盖密封时注意，不要将螺丝逐个上紧，要把每个螺丝卡好，以相对方向的螺丝平衡用力拧上，注意不要太紧，所有螺丝拧好后再用力将相对的螺丝平衡用力拧紧。这样做不但可以将锅盖密封紧密而且还可以避免漏气现象发生，延长高压锅的使用寿命。

　　4.4  灭菌过程中的放气是至关重要的，放气阀紧连的金属管直通到内胆底部，目的就是在放气时将底部空气完全排净，若排不净空气，空气自身产生的压强会占据压力表上显示的总压强，降低水蒸气产生的压强，误认为灭菌锅内的灭菌压强已达到灭菌要求，最终造成灭菌不彻底。所以在排气时注意大火加温至压力表指针达到0.05Pa时打开放气阀放气，待指针降下来后重复上述操作直到放气阀喷出大量雾状水蒸气为止。

　　4.5  放完气后继续加热待指针指到121℃或0.12Pa时，通过断电或停火让指针维持不变计时30min，注意在维持压力计时时一定要留有专人看管，切忌灭菌时一心多用，严防压力过高造成危险。

　　4.6　计时完毕后，停止加热让高压锅自然冷却，冷却至0.05h以下即可放气，注意放气时应轻提放气阀，不要猛提放气阀，由于锅内压力过大会造成水蒸气外喷范围较大，要谨防烫伤操作者。还应切忌当压力还未降至0.05h而打开放气阀，不但会有烫伤的危险，更重要的是产生的巨大压差会使试管内的培养基沸腾，造成培养基外溢污染棉塞，严重者试管会在锅内爆裂。

　　5  冷却

　　5.1  当压力表降至0时，待锅体略微冷却，拧开螺丝打开锅盖，注意不要将试管立即拿出，由于锅内水蒸气含量较大，试管内及棉塞含水量也较大，直接冷却会导致试管内有冷凝水及棉塞含水量过大，影响接种、发菌，还会加大管口处污染的机率。打开锅盖后，让锅内大量的水蒸气散发将试管内及棉塞中的水气带走一些，直到包裹试管的纸张见干时即可拿出摆斜面。

　　5.2  摆斜面的环境要求洁净，因为斜面摆放环节是高压灭菌和无菌接种之间试管培养基与环境接触的中间环节，为降低.试管培养基污染的机率，摆斜面的环境要求洁净、定期灭菌。

　　5.3　摆斜面时要趁培养基未凝固前摆放，注意摆放前要朋试管倾斜一定角度旋转一周将试管内壁上附着的水珠溶于培养基内，降低冷却后试管内的含水量。

　　5.4  摆放时将管口垫起一定高度，使试管内的液体培养基倾斜，斜面长度可占试管长度的3/5，注意不要将斜面摆的过长、距离棉塞过近，因为菌丝在生长过程中接触到棉塞会极易污染杂菌。

　　5.5  如果制作的试管培养基是为了保存菌种，摆放斜面时注意要让培养基充分填充试管半球状的末端，目的是延长试管菌种的保存时间。

　　5.6  注意在用制作好的试管培养基接种前要检查试管培养基的灭菌效果，这一步非常关键。夏季温度较高，斜面培养基放置12h即可；冬季温度较低，斜面培养基要放置24h，有条件可放入恒温箱内12h。将放置好的斜面培养基对着光源观察培养基斜面，若斜面光滑证明灭菌彻底无杂菌污染，若斜面不光滑（有细菌状、霉菌状等）表明灭菌不彻底，需要重新灭菌。

　　以上是在实际制作母种培养基中总结的几点注意事项，通过了解制作母种培养基的每个步骤和注意事项，希望能对从事菌种制作的技术人员和食用菌栽培户有所借鉴和帮助。