二级种是将一级种移接在有二级种培养料中制成的菌种。二级种可以直接作生产种用。一般二级种转接到同一种培养料上进行扩大培养就成生产种。二级种一般装在750毫升蘑菇瓶或塑料袋中。
 （1）培养料的配制
    配方一：稻草90%，麸皮（米糠）9%，石膏粉1%。配制方法是选取金黄色、无霉烂的干稻草，切成3厘米长，在清水浸泡12小时左右，使之充分吸水（只有吸透水的稻秆灭菌才容易彻底），捞起后挤掉多余的水分，按比例加入麸皮、石膏粉，充分拌匀，湿度以手握有水珠连续滴下为适宜。然后装入瓶中，一面装一面用木棒压实，松紧要均匀适中，一般750毫升瓶装干草75克。培养料装至离瓶口约5厘米处为好，不宜太满。接着用尖木棒在中央打一小洞，伸至瓶中部，以利接种。洗净瓶口内外附着的培养基，擦干瓶口内壁后塞上棉塞，灭菌。
    配方二：棉籽壳94%，麸皮5%，石膏粉1%，石灰6%。配制方法：将棉籽壳预湿后加入辅料，含水量在60%左右即可装瓶（袋）。
    配方三：麦粒98.5%，石膏粉1%，碳酸钙0.5%。配制方法：先将麦粒用12%～15%的石灰水浸泡10小时左右，加热煮沸15分钟，然后过滤，让麦粒稍微收干，冷却后拌入石膏粉和碳酸钙，立即装瓶。装瓶时瓶底放一薄层湿度为30%～40%的砻糠，瓶肩处装一薄层棉籽壳或砻糠为封口料，以减少杂菌污染。其余培养料的装瓶方法同配方一。此法宜做二级种，如做生产种，由于营养较好易引起污染。
   （2）灭菌 装好培养料的瓶（袋）要当天灭菌，以免料发酵变质。灭菌压力为137～147千帕，灭菌1.5～2小时。如用常压灭菌灶，则需将水煮沸后保持8小时，并闷一夜，也能达到灭菌目的。
   （3）接种 灭菌后随即把菌种瓶（袋）取出送至接种箱或超净台，冷却后即可接种。一般每支一级种接4～8瓶二级种，每瓶二级种接60瓶左右生产种。
   （4）培养 接种后将菌种全部移至培养箱或培养室。室温以30～32℃为宜，24小时后即可检查。在菌丝封口前最好每天检查一遍，及时拣去污染的菌种。菌种长满瓶后3～5天为最适菌龄，750毫升蘑菇瓶的菌龄25～30天。特别要指出的是培养室要清洁、通风，室外环境也要清洁。