当料袋冷却至30℃以下时移入接种箱接种，接种箱用高锰酸钾、甲醛熏蒸灭菌，20分钟进行无菌操作接种。接种从料袋两端进行，一般每瓶菌种可接25袋。接种后可将料袋直接移入大棚培养发菌。移入前大棚应充分消毒，开窗降低棚内温度，用石灰水喷洒地面和四壁，然后用甲醛或硫磺密闭熏蒸24小时。如采用冬暖蔬菜大棚栽培猴头菇，可先将接种后的料袋单独置于培养室培养至菌丝吃料深达2厘米左右，再移入大棚内继续培养。料袋呈墙式排放，每行叠放6层，底面铺一层砖，行间距60厘米，以便于管理。
    发菌培养期间要加强通风管理，棚顶适当加放草帘遮荫，控制棚内温度不超过27℃，约经30天，菌丝接近发满时，倒袋检查，清除有较重杂菌污染的菌袋，生长健壮的菌袋即可进行出菇管理。