经过灭菌的塑料袋必须冷却至25℃左右时方可接种。一般是塑料袋灭菌后的第二天即可接种，夏天不超过3d，冬天不超过5d接种为好。否则不仅培养基易失水，而且污染率高。接种的关键是严格无菌操作，正确掌握熟练的接种技术，动作力求准确迅速。接种前要先做好两项准备工作：一是选择质量合格的菌种，菌龄以不超过2个月的为宜。若菌种瓶中长有小原基的菌种，只要时间短，原基未发生腐烂或变色的，仍可使用。接种时把原基弃除即可。而已长出子实体且菌盖又开伞的菌种，因已弹射出担孢子，菌种纯度降低不能使用。二是接种前要进行消毒，除去物品表面上的病原菌。常用的消毒剂有下面几种：
    (1)甲醛(福尔马林 HCHO)：无色气体，极易挥发且穿透力极强，有强烈的刺激味，会刺激人的皮肤、黏膜，其40％的水溶液称之为福尔马林。甲醛在冬季常会析出乳白色的聚合物。甲醛易与蛋白质(包括酶)结合而使蛋白质变性，引起菌种和芽孢死亡。甲醛或福尔马林是一种强杀菌剂，常用于接种箱、接种室、培养室、栽培房的熏蒸消毒。挥发甲醛的方法有直接加热法和氧化还原反应法两种。直接加热法是将福尔马林置于容器中，直接在酒精灯上加热蒸发；氧化还原法是甲醛与高锰酸钾反应产生大量热，使甲醛蒸发。
   (2)高锰酸钾(KMn0₄)：暗紫色棱状晶体，强氧化剂。溶于水，呈紫红色液体，具有强烈的腐蚀性。高锰酸钾将酶的-SH基氧化为S-S基，使酶失活，导致菌体死亡，是一种高效的消毒剂。0.1％浓度的高锰酸钾水溶液作用10-30min即可杀死微生物的营养体。2％-3％溶液短时间作用可导致菌体和芽孢的死亡。其水溶液暴露在空气中易分解，应随配随用。
   (3)漂白粉[主要成分为次氯酸钙Ca(Ocl)₂]：白色颗粒粉末，有氯臭，极易潮解，易溶于水、不稳定，遇二氧化碳、光、热分解。本品含氯量为25％，呈碱性。次氯酸钙加水可分解生成次氯酸(HOCl)，有较强的杀菌作用。杀菌原因是由于它在分解时释放出氧气和初生氧(O)。O和Cl₂的联合作用，侵入细胞与菌体蛋白内使酶发生氧化，促使细胞和病毒死亡。新鲜的有效氯极易挥发失效，需密封，以防潮解。通常使用浓度为2％-5％的水溶液，随配随用，不能久放。直接喷洒地面，用量为20-40g／m²。
   (4)酒精(乙醇 CH₃CH₂0H)：无色透明液体，易挥发，有强烈的酒气味，易燃，沸点为78.5℃，可与水任意混溶。使用乙醇消毒，浓度为70％，作用5min即可杀死细胞营养体，对真菌孢子则需要30-60min。乙醇能使蛋白质脱水变性，干扰微生物新陈代谢，抑制其繁殖。95％乙醇杀菌能力反而减弱，因为它接触菌体后，立即引起菌体表面蛋白质的凝固，形成保护膜，不易渗透入细胞内，故杀菌能力减弱；而70％酒精能渗入菌体细胞，解脱蛋白质表面的水膜，引起新陈代谢障碍，使其失去活性，故有较强的杀菌力。用95％的酒精700ml加水250ml即配成70％的酒精950ml。70％的酒精常用于手的消毒及橡胶手套等制品的消毒。
   (5)石炭酸(苯酚 C₆H₅0H)：低温下的苯酚为无色或白色针状、块状或三菱形晶体，有特殊气味和腐蚀味。在空气中易氧化变红色，熔点为42-43℃。65℃以上能与水任意混合。石炭酸可杀死微生物的营养体，高浓度下可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝聚沉淀；低浓度下可使细胞的主要酶系统失去活性，一般用5％苯酚水溶液作为消毒剂，配制时，先用热水溶化，再加入所需的。
   (6)来苏儿(煤酚皂溶液 C₆H₄OHCH₃)：黄棕色至红棕色黏稠液体，有酚臭，甲酚含量为48％-52％。来苏儿的杀菌力为石炭酸的4倍，杀菌机理与石炭酸相同。1％-2％来苏儿溶液可用于皮肤浸泡(2min)，2％-3％可用于喷洒消毒。常与新洁尔灭、石炭酸等交叉使用于接种箱、无菌室、培养室消毒。
   (7)新洁尔灭(十二烷基二甲基苯甲基溴化铵 C₂lH38NBr)：淡黄色胶体状，是阳离子型的表面活化杀菌剂，多作用于菌体的表面，通过阴阳电荷结合，破坏菌体外膜结构，从而改变细胞壁透性，使菌体肿胀死亡。对无芽孢病原菌、霉菌等具有较强的杀菌作用，效果为石炭酸的几十倍，消毒特点是快速、彻底、高效。新洁尔灭浓度为5％，使用时可稀释20倍，即0.25％浓度，一般用于接种箱、玻璃器皿表面消毒，不适于橡胶手套的消毒，对皮肤及黏膜有轻度刺激，配制后可存放1个月，当溶液呈现显著黄色或产生较多沉淀时，即应废弃。
   (8)硫黄：淡黄色结晶或粉末，易燃，发出蓝色光，产生二氧硫，对杂菌有较强的杀菌能力，若增加空气湿度，二氧化硫和水结合为亚硫酸，能显著增强杀菌效果。常用于熏蒸接种室、培养室。每立方米空间用15g左右为宜。对于周围环境卫生状况较差的培养室或栽培室，使用硫黄熏蒸既经济，效果又好。