培养室也称恒温室，用于培养接种后的各级菌种。培养室必须提供适宜的温度和通气条件，以促进菌丝良好的生长发育。培养室的大小和数量根据生产规模而定。培养室必须有较好的保温结构，门窗需能关闭紧密，最好做双层门窗和夹层墙壁，夹层内填塞保温材料如木屑、谷壳、玻璃纤维或泡沫塑料等绝缘较好的材料。培养室的门上最好挂棉帘布，防止冷空气进入培养室。室内若用电炉提供热源时，需配置电子继电器和导电温度计，可自动调节培养室的温度，不仅非常方便，而且能保持恒温状态。也可用炭炉提供热源，但必须注意把木炭燃烧时产生的二氧化碳气体排出室外。气温偏高时，可用空调机进行调温培养。培养室要求消毒干净，进入培养室需调换鞋子，室内地面用拖把沾水清洗，不宜用扫把打扫房间，以免灰尘中的杂菌孢子四处飞扬，影响菌种的正常培养。