土壤为羊肚菌生长提供所需的营养物质，与营养袋同样重要。土壤处理是羊肚菌种植前重要的准备工作。洁净松软的土壤是羊肚菌发菌和生长的基础。提前杀虫杀菌，避免后期病虫害的产生，提前增加底肥，有助于产量的提高。
羊肚菌以土壤为子实体形成的基质，菌丝生长、原基形成和子实体发育均在土壤中完成，土壤的性质是决定羊肚菌栽培成败的关键。但土壤对羊肚菌生长的影响是一个十分复杂的体系，也是目前知之甚少的领域，什么样的土壤适宜羊肚菌栽培一直是广大投资者关注的重要问题，但对适宜土壤的选择多来自生产实践经验，还较缺乏更多的科学数据支持。
羊肚菌出菇与土壤中矿质元素含量相关。相关专家研究了羊肚菌产地土壤矿质元素含量，认为土壤富含磷、钾、锌是羊肚菌发生的必要条件，在气候条件适宜的情况下，羊肚菌的产量与土壤微量元素锰、铜、锌、铅、镍等全量分布背景值成正相关。
土壤微生物与羊肚菌子实体的形成有非常密切的关系。土壤中含有的微生物，其中如拟青霉、镰刀菌和链孢霉等对羊肚菌有致病性，一些无致病性甚至有益的微生物在适宜的条件下也有可能成为有害菌，土壤中病原菌的大量生长，将显著降低羊肚菌产量，甚至造成绝收。
专家对四川平原地区集中连片不出菇的栽培区域采集土壤样品，分析结果显示，土壤理化性质如pH、土壤中C，N，P，K等差异并不是造成羊肚菌不出菇的主要原因，土壤中微生物生态对出菇有更重要的影响，土壤微生物多样性对羊肚菌子实体的形成有重要作用。
连续在同一地块上种植羊肚菌，一般连续2年以上种植就会观察到羊肚菌产量明显下降和病虫发生率上升，连作障碍明显。一般认为羊肚菌生长会从土壤中吸收偏好的矿质元素，不断积累次级代谢产物，造成土壤中微生物区系变化，从而影响产量，有效防止连作障碍的栽培方式是水-旱轮作方式。有专家连续7年在同一地块利用水旱轮作的方式，实现了羊肚菌稳产和丰产。
羊肚菌的生产对土壤有改良作用。研究表明，羊肚菌栽培提高浅层土壤pH，有效增加土壤表层的有机质、土壤速效氮和全磷含量，土壤蔗糖酶和脲酶活力都显著高于对照组，羊肚菌菌丝体能提高土壤中蔗糖酶和淀粉酶活性。在铅污染的土壤中，羊肚菌菌丝体分泌代谢物，导致盐晶形成，降低土壤中生物可利用铅含量，可有效提高土壤肥力，增加作物产量，并保障质量安全。
土壤具有高度复杂性和空间异质性，且含有众多干扰因素，成为阻碍羊肚菌营养生理研究的主要瓶颈。近年来研究发现，天然土壤作为羊肚菌的栽培基质并不是不可替代的。
专家以石英砂为骨架的半合成基质作为土壤的替代物，将常规羊肚菌栽培的农田土壤生态系统转化到一套更为简化可控、易于观察的模型上，在羊肚菌生长出菇过程中对栽培基质微生物群落演替和营养物质代谢积累进行分析。
利用该研究方法，确定了半合成基质中的微生物群落演替及积累碳氮养分的种类与出菇产量密切相关；出菇消耗碳源主要为脂类，氮素中硝态氮比铵态氮的比值越高，越有利于羊肚菌高产。
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