用香菇的组织、孢子或菇木的菌丝经分离、纯化和转管培养出来，再用于繁殖原种或保存用的菌种，称为母种。但具体如何繁育？有以下几项要点。
一、菌种分离
1. 组织分离
要培养出优良的菌种，必须要有好的母种，好的母种又来源于健壮的香菇个体，因此，首先必须选择发育正常、个体健壮、没有虫咬的新鲜菇蕾作为分离的材料。菇蕾采回后，不需用水洗，也不需用药水消毒。放入干净的培养皿内，用消毒过的手或解剖刀将香菇从中剖开，在盖与柄接触的部分切取黄豆大小的菌肉，放在已准备好的培养基上，塞上棉花即可。
2. 孢子分离
选择个体强壮，八分成熟的香菇，除去菌柄，菌褶朝下挂在玻璃漏斗上一条特制的铁丝钩上，漏斗盖住培养皿(培养皿放在一只垫有纱布的搪瓷盆中)，静放12-20小时，菌褶上的孢子（种子）便大部分落在培养皿内，形成一层白色粉末状物，即可作为分离培养使用。
孢子接种时，用接种针取出少量孢子，用无菌水配制成孢子悬浮液。再用接种针，取出少量悬浮液，用划线的方法接种于培养皿内的培养基上，待孢子萌发，生成菌落后，选择孢子最先萌发并生长最好的菌落进行纯化转管繁殖。
3. 菇木菌丝分离
选取未出过菇或刚出过菇不久、但已恢复菌丝生长的菇木（肉眼看不见杂菌）一小段，拿回室内，不需表面消毒，用皮带冲在要分离的部分，将树皮取掉，然后用酒精消毒，冲口在酒精灯火焰上灭菌，灭菌后，打入菇木已取皮的部分，迅速取出皮带冲，用灭过菌的小剪刀在冲口菇木块中间，剪下黄豆粒大小的一块，接入培养基上即可。
以上三种分离法，整个过程均应在无菌室内进行，一切用具均应经过严格消毒，以防杂菌污染。无菌室事前要用5%的石炭酸喷射，有条件的再经过紫外线灯照射20-30分钟。接种台上最好铺上一块用2%的来苏尔消毒过的湿纱布。
二、培养
菌种分离接种后，放在25℃左右条件下培养，两三天即可看见白色棉花状的菌丝从菇肉或木块上长出，三、四天便可看见从孢子萌发出的白色菌丝，十多天整个试管长满菌丝。在培养过程中如发现试管中的培养基上有青的、绿的、黄的或糊状物出现时，说明已被杂菌污染，不能用了。因此，在分离菌种时通常应分几管，以选择生长最优良者，进行纯化或作为母种转管繁殖。
以上三种分离法，常用的是组织分离法，因无性繁殖变异较小，操作容易，又不易带进杂菌。在没有香菇的情况下，可用菇木菌丝分离法。如要用杂交法育种，则必须用孢子分离法，而且要挑取单个的孢子进行杂交。
三、纯化
组织分离不易带入杂菌，但孢子分离时往往带入杂菌，因此必须进行纯化。即在培养基上挑取香菇菌丝放入新的培养基上，连续几次便可得到纯的香菇菌丝种，这一过程称为纯化。
四、母种的转管繁育
将一条试管的母种分接于许多条试管内繁殖，称为转管繁育。一管母种可转30管左右。接种体大，菌丝生长快；接种体小，则菌丝生长慢。方法：用经过消毒的接种钩把母种连同培养基钩一小块，约0.5平方厘米放入母种培养基的中间，以利菌丝迅速繁殖。
整个过程也要进行无菌操作。培养温度在25℃左右，接种后一天，便可见从接种体上长出白色的菌丝，十多天菌丝长满全管，便可用来接入原种培养基内或作为母种保存。
五、母种保藏
保存菌种最好用马铃薯、葡萄糖或白糖培养基，不宜用木汁琼脂培养基，因后者菌丝生长快，易老化。在常温下母种可以保存2-3个月（如时间过长，培养基因水分蒸发而干缩，菌种老化），如果继续需要，必须及时转管保存。在梅雨季节和高温多湿的夏天，要特别注意杂菌污染。
在低温下，培养基水分蒸发慢，同时菌丝新陈代谢慢或停止，菌种保存的时间可长些。在1-4℃的冰箱内，菌种可保存半年左右，但必须注意勿使棉塞潮湿而长杂菌。保存温度不能太低，否则斜面培养基要结冰脱水，菌种特性易衰退或死亡。
放在低温长时间保存的母种，使用前必须先将菌种放于适温下，让其苏醒后再即时使用（久放菌种易衰退），否则转管不易成活。为防止菌种因多次转管而发生退化或变异，在2-3年内应重新分离保存。
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