组织分离是最常用的分离方法。该方法较孢子分离相对简单，获得的菌种性状相对稳定，分离后代的基因型和亲本基因型一致，可以在一定的世代范围内传承亲本的优良性状，因此组织分离是目前应用最广泛的分离手段，也是一些菌种定向选育的筛选方法，但是并非组织分离法适用于所有材料。
经验表明，一些种类的组织分离物，绝大多数丰产性有所下降，如平菇、双孢菇等。长期从事羊肚菌的朋友一定也发现过，你采集的新鲜标本，存在着一定概率完全分离不出来的情况，这就是羊肚菌组织容易老化的一个表现，老化的菌株肯定是不能用于生产的。
组织分离的具体方法是：取半成熟至成熟的健壮新鲜子实体，0.1％升汞或75％酒精表面消毒。如果是干标本，则用无菌水振荡冲洗、泡开后用再升汞或酒精进行消毒处理。在消毒之前，还可以用吹风机冷风吹去表面的附着物和杂菌，用升汞或酒精表面擦洗，特别是菌柄部分。在无菌条件下从子实体中间纵向掰开，用尖嘴镊子或解剖刀小心取菌盖与菌柄交界处或菌肉厚的部分（即远离组织表面）约1~3mm大小的菌肉组织，置于适宜培养基上，在适宜温度下培养。当菌落长至直径1 ~ 2 cm时进行转管纯化。
下面根据羊肚菌的特点详解羊肚菌的组织分离步骤：
1）用具和材料准备：酒精灯、打火机、75%酒精棉球、解剖刀、尖嘴镊子、顿口镊子、挑针或接种针、无菌吸水纸或滤纸、75%的酒精或0.1%的升汞（氯化汞）溶液、无菌蒸馏水、斜面试管或倒好培养基的平板、超净工作台，以及待分离的新鲜羊肚菌子囊果。
2）将上述用具置于超净工作台中，开紫外灯，表面杀菌20 ~ 30 min；之后关闭紫外灯，放入待分离的子囊果标本；打开风机，中高档风速吹风5~10 min。
3）打开超净工作台白炽灯，风速可以减少到中低档位；用75%的酒精棉球擦拭双手，进行表面消毒，再用新鲜的75%酒精棉球对超净工作台台面进行擦拭。
4）用略干的酒精棉球将子囊果菌柄特别是基部与土壤交界处的灰尘或泥土擦拭干净，擦拭过程中及时更换酒精棉球；将擦拭干净的子囊果用解剖刀切取菌柄0.5×1 cm组织块2~3块，或取菌柄与菌盖交接处组织较厚的部位；将组织块置于0.1%的升汞溶液内浸泡0.5 ~ 1 min（或75%的酒精内浸泡2 ~ 3 min），根据材料不同，需要调整浸泡时间，可以先从短时间开始，依次检查效果，避免升汞或酒精将羊肚菌菌丝全部杀死。
5）取出浸泡在升汞或酒精溶液中的组织块，置于无菌蒸馏水中漂洗1 min，取出后置于无菌的吸水纸上，吸干水分。
6）用干净的尖嘴镊子或解剖刀撕开菌肉，尽可能取内部组织0.2~0.3 mm³，置于斜面或平板培养基上；或直接用解剖刀切取组织菌肉0.3~0.5 mm³，置于斜面或平板培养基上。
7）斜面口朝上或平板封口后倒置，20~23℃恒温培养箱培养。
8）36~48h后，检查接种块是否萌动。初始的萌发菌丝稀疏，一根根清晰可见，长约0.2~0.4 cm，菌丝粗壮；56~72h后，成功萌发的菌丝将长至0.5~1.5cm长，菌丝纤细，无色，不浓密，前端近似整体，根根分明，此时可挑取菌落尖端进行挑出纯化或再等最多一天后挑出纯化。
9）纯化的羊肚菌8 ~ 12h左右，可见到从接种块萌发到培养基上的新生菌丝，初始的新生菌丝形态和8）所述状态一致，稀疏、无色、薄、根根分明；通常18×180 mm的斜面试管，4 ~ 5d左右可长满试管，具有一定的爬壁能力，此时，培养基表面的菌丝密度较之前明显增大，试管壁上有一层稀疏但明显的菌丝物，菌落前端略整齐，有齐头并进之势。4 ~ 7d间，开始在培养基表面形成白色、针尖状、不规则颗粒状，约直径1mm左右的白色菌核，依据所分离品种的不同，菌核呈分散状或凝集呈片状。7 ~ 10 d，菌核有初始的白色、小，逐渐变浅黄变大，依据品种不同，菌丝开始出现少许色素，菌丝开始有初始的无色、白色至浅黄色、浅棕黄色。
10）10 ~ 14 d的培养时间，将培养物移入4℃冰箱保藏备用。
对于干标本的材料，可以用无菌水泡胀后按新鲜标本操作流程进行分离，但难度比新鲜标本大得多。
对于比较干净的幼嫩组织材料，可以略过升汞浸泡流程，在表面去杂消毒后，用解剖刀劈开子囊果，尽可能取不接触空气的组织进行分离，技术娴熟者依旧可以达到非常好的效果。（来源：羊肚菌生物学与栽培技术）
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