1、菌种分离
目前可以纯人工栽培的羊肚菌品种有变红羊肚菌、梯纹羊肚菌、尖顶羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌以及粗柄羊肚菌、普通羊肚菌。当前我国的栽培品种主要以黑色品系为主，梯纹羊肚菌占总栽培面积的95％以上，产量及稳定性最好；六妹羊肚菌和七妹羊肚菌次之，产量稳定性与梯纹羊肚菌相当，开发潜力较大；黄色品系粗柄羊肚菌栽培规模较小，产量及稳定性有待进一步提高。
采用孢子分离、组织分离或基质分离法获得纯菌种。分离物必须经过纯化鉴定，并经出菇试验方可大规模栽培使用。通常情况下，分离物在20℃～25℃培养2d即可萌动，3d左右即可形成初生菌落，挑取萌发菌落的尖端进行纯化或扩大培养。
2、母种培养
各种真菌培养基均适合羊肚菌菌丝的生长，通常情况下，菌丝在25％条件下培养4d～7d即可长满试管，5d～8d开始形成菌核。
母种培养基：PDA培养基，马铃薯200g(煮汁)、葡萄糖20g、琼脂18g～20g，自来水1000mL，pH值自然；CYM完全培养基：葡萄糖20g、蛋白胨2g、酵母膏2g、卧磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.46g、琼脂粉20g，蒸馏水1000mL。
优良母种表现为菌丝生长均匀，初期菌丝密集洁白，粗壮，气生菌丝旺盛，爬壁力强，后期菌丝产生浅棕黄色色素，菌落浅棕色至棕色。大部分羊肚菌菌株在培养4d～6d开始产生菌核，菌核初期白色，针尖大小，后期芝麻粒至绿豆粒大小，分散或凝集呈片状，菌核随着生长时间增长开始变黄，最终为棕黄色。
3、原种、栽培种培养基
原种、栽培种培养基配方基本相同，常压或高压灭菌后使用，常用配方如下：
杂木屑70％、麦麸20％、生石灰1％～2％、石膏1.5％、腐殖质土10％；
杂木屑60％、小麦25％、生石灰l％～2％、石膏1.5％、腐殖质土15％。
每个18mm×l80mm母种块转接6瓶原种，每瓶原种转接50袋～55袋栽培种。750mL菌种瓶生产原种，22℃～25℃暗室培育，15d～20d即可长满，25d可用于栽培种制作。栽培种选用14cm×28cm丙烯或乙烯菌种袋，25d长满，约30d即可使用。每公顷栽培种用量4500袋，大约300kg～3375kg菌种。
4、“外援营养袋”配方
“外援营养袋”配方：可以与栽培种相同，或者玉米芯40％、谷壳25％、小麦20％、生石灰1％一2％、石膏1.5％、腐殖质土15％。“外援营养袋”选用12cmx24cm乙烯或丙烯菌种袋。每公顷用量27000袋～30000袋。“外援营养袋”装袋后进行常规灭菌操作，待冷却后即可使用。
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