所谓有性孢子，是指细胞已经过核配过程和减数分裂而产生的孢子，为子囊孢子。有性孢子含有双亲的遗传物质，具有双亲的遗传性。孢子具有生命力强、数量多、变异率高、范围广的特点，因而采用孢子分离法，从中选择优良菌株的机会更多。但是，孢子分离法过程较繁琐，工作量大，所需时间长，必须通过出菇试验以后才能在生产上使用。

羊肚菌菌种孢子分离方法包括多孢分离法和单孢分离法。

多孢分离法是将许多个孢子接种在同一斜面培养基上，使其萌发，自由交配获得纯菌种的方法。此法操作简单，在食用菌制种中应用较普遍，常用的方法是划线法。在无菌条件下，用接种环在三角瓶底部蘸取少量的孢子，在斜面培养基上自下而上轻轻划线，避免划破培养基表面。划线接种完毕，灼烧试管口，塞上棉塞，置羊肚菌于适宜的温度下培养。待孢子萌发出菌丝，挑选发育匀称、生长快速的菌落，移至到新的试管斜面上继续培养，即可得到纯菌种，再经出菇试验后即可作为母种扩大繁殖。

单孢分离法是在采集到大量孢子的基础之上，经过稀释，使孢子之间互相分开，各个孢子单独萌发出菌丝，从而获得纯菌种。单孢分离法在生产上直接应用不多，主要作为研究食用菌生物学特性和遗传育种的一种重要技术手段运用。

标本采集：一定要采集成熟的有大量子囊孢子的子实体。野生羊肚菌子实体很容易成熟，一般稍大一点的都能成功获得孢子。栽培的子实体在采收标准大小状态都没有成熟的孢子时，必须等其继续生长到子实体表面有少量白色粉末状物出现，子实体明显老化或倾斜时才有成熟的子囊和子囊孢子。

孢子弹射方法：采集成熟的野生或栽培羊肚菌子实体，剪掉菌柄基部，用吸水纸包裹，立即保存于冰袋保温箱内，带回实验室。孢子采集可采用三角瓶钩悬法，采集器主要由三角瓶、金属挂钩(悬挂种菇)棉塞等组成，三角瓶底部放入固体母种培养基或用75%的酒精棉球对种菇进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次、无菌纱布吸干表面水分。在无菌的条件下，取经火焰消毒后的金属挂钩，一头钩住子囊果菌柄，另一头钩在瓶口上，瓶口加棉塞。此后，将孢子采集器置于适宜温度下，羊肚菌孢子弹射的温度为20~25℃，有风可促进孢子弹射，经1~2天后，待看见瓶底有层孢子层时，即可在无菌的条件下，取出种菇和金属钩。如果三角瓶内有固体培养基，可直接适温培养，待孢子萌发在培养基表面形成小菌落时，再挑取无污染、长势良好的菌落，连同培养基一起，移到斜面试管培养基中继续培养。如果三角瓶内没有培养基，可直接收集孢子进行斜面培养。如果需要长期保存，可把盛有子囊孢子的三角瓶放入冰箱内冷藏。（综合自百度百科，《羊肚菌生物学基础、菌种分离制作与高产栽培术》贺新生著；《羊肚菌栽培新技术》贾乾义）