1. 菌种选育
一般采用组织分离法进行菌种选育，此法具有操作方便，菌丝萌发快，能保持原菌种的优良种性等特点。
（1）选优良菌株。从野外或者室内选生长健壮、大小适中、无病虫害八成熟的、第一批优良蛹虫草菌株。
（2）消毒。将鲜蛹虫草用清水洗去外表泥土，用75%酒精浸泡3～5秒钟，无菌水冲洗2～3次，再用0.1%升汞水溶液消毒l～3分钟，用无菌水冲洗3～5次，洗净后进行分离。从室内选的菌株仅需酒精消毒，无菌水冲洗即可。
（3）分离。纵剖有龟背状花纹的蛹虫草顶端组织子实体，用尖头镊子取内部白色组织块，取绿豆粒大的组织接种到已消毒的斜面培养基中部。
（4）培养。把已接种的斜面培养基放在培养室培养，培养室杀菌消毒，避光，保持培养室的温度25℃左右，空气湿度60%左，经常检查，把污染的去除，培养5～10天，菌种已培养好，挑选性状优良的菌种作为母种。
（5）优良菌种标准。白色菌丝粗壮浓密，且紧贴培养基匍匐状生长，边缘整齐，气生绒毛状菌丝少，见光后菌丝变为橘黄色。
2. 菌种提纯
（1）消毒。将优良母种和已消毒的斜面培養基试管放入超净工作台内。先用肥皂洗净双手，再用75%酒精棉球擦手和菌种管表面，在酒精灯火焰上灼烧消毒。
（2）转管。转管时两手从接种孔伸入超净工作台内，75%酒精棉球擦拭接种环。左手持菌种管和斜面管，两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种环，并将其在酒精灯火焰上干热灭菌，用小指及无名指拔掉棉塞，使棉塞底部朝外。接种环冷却后伸入菌种管内取黄豆粒大并带有薄薄培养基的菌丝块，迅速移入斜面培养基的中部，菌丝朝上。然后，将棉塞在火焰上烧一下，立即塞入试管口，旋紧棉塞。
接种环不要触碰管口及管壁，以防感染。适温培养5～10天左右即可。
3. 出草实验
将提纯菌种，在无菌条件下接种到培养基上，在培养室培养。在温度为18～22℃，湿度适宜的条件下培养20～30天，即可形成橙红色子实体。
4. 菌种复壮
菌种繁殖应无性繁殖与有性繁殖交替进行，否则菌种性状易退化，其表现为出草不整齐、畸形，甚至不出草。因此，在生产过程中应及时对菌种进行有性繁殖来提纯复壮。
（1）消毒。选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体消毒。
（2）接种。将消毒的子实体悬挂于装有PDA培养基的无菌三角瓶内。
（3）培养。接种的三角瓶在25℃左右条件下，在无菌室静置培养一天，当三角瓶的培养基表面出现大量蛹虫草的白色菌丝时，在超净工作台上挑取单个或多个菌丝，用接种环接种到试管斜面培养基中部进行培养。当蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。获得的母种经出草试验后，选择优质蛹虫草子实体再进行组织分离法培养，获取的母种可以扩繁栽培种。
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